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柱層析法是世界各國(guó)實(shí)驗(yàn)室常用的純化技術(shù)。若操作得當(dāng)，我們可以快速?gòu)幕旌衔镏械玫轿覀冃枰幕衔铩：突瘜W(xué)實(shí)際操作的諸多事情相似的是，如果沒(méi)有幾年甚至十幾年的經(jīng)驗(yàn)積累，色譜柱的快速及有效安裝的確會(huì)成為一道坎兒。今天我們?yōu)榇蠹铱偨Y(jié)的就是有關(guān)色譜柱填充這一環(huán)節(jié)應(yīng)該注意的那些看似平常但也有很多講究的問(wèn)題。
我們以一般常用的色譜柱為例，如圖1所示，其固定相為固體吸附劑，一般使用的是硅膠（SiO2）或者氧化鋁（Al2O3）。流動(dòng)相為液體，從柱體頂端加入，沿著柱體在自身重力或者額外壓力（快速色譜法）的作用下流動(dòng)。固定相和移動(dòng)相之間的相互作用和不同的吸收程度實(shí)現(xiàn)了化合物的分離。
圖1. 常見(jiàn)色譜柱結(jié)構(gòu)示意圖。
影響分離效果的因素很多，不僅僅氣泡會(huì)影響分離，為了避免汽包的出現(xiàn)，必須正確的進(jìn)行柱體填充。
1.選擇固定相填充料
二氧化硅和氧化鋁都屬于極性吸附劑，所以需要分離的混合物中含有極性成分越多時(shí)，混合物就越容易貼附在固定相上，因此柱子的洗脫會(huì)需要更長(zhǎng)時(shí)間。大多數(shù)的化合物的分離都可以使用二氧化硅，但由于二氧化硅有微酸性，因此它會(huì)優(yōu)先保留基本化合物。氧化鋁具有弱堿性，因而對(duì)酸性化合物的保持能力很強(qiáng)。對(duì)弱性或中等極性組分的分離和胺的純化有很好的效果。
吸附劑顆粒物的大小也會(huì)影響流經(jīng)柱體的流動(dòng)相。二氧化硅或者氧化鋁的顆粒物的大小有多重選擇。
下文介紹的填充技術(shù)主要以二氧化硅為例，但同樣適用于氧化鋁。
2.準(zhǔn)備色譜柱
有些柱子含有玻璃粉（如圖2的左側(cè)這一根）玻璃粉的作用就是防止固定相下降至柱子底端，但那些沒(méi)有玻璃粉的柱子，我們就需要使用棉花團(tuán)或者玻璃棉團(tuán)塞入柱子底端。使用哪種柱子可依據(jù)個(gè)人喜好來(lái)定。
一開(kāi)始選擇玻璃棉團(tuán)和棉花團(tuán)的塞入位置時(shí)比較棘手，即便如此，但是玻璃粉也有自己的弊端——清潔較困難，而且也會(huì)成為雜質(zhì)的來(lái)源，比如說(shuō)二氧化硅會(huì)沿著玻璃粉泄露流至收集段。為了防止泄露的發(fā)生，可以在二氧化硅和玻璃粉之間鋪一層砂礫。
玻璃粉本身也有很多孔洞，而且也不盡相同。這意味著溶劑的流速會(huì)因柱子的不同而不同。如果玻璃粉的孔洞很多，那么流經(jīng)的二氧化硅會(huì)更多，如果孔洞數(shù)量較少的話，那么流速也會(huì)相對(duì)較慢，但有時(shí)候流速過(guò)慢的話，快速色譜柱的壓力會(huì)變大。
圖2.含玻璃粉（左側(cè)）和不含玻璃粉（右側(cè)）色譜柱。
玻璃粉柱子
找一支干凈沒(méi)有異物的大小合適的柱子。
緊緊的夾住柱體并關(guān)閉旋塞閥（如圖2右側(cè)那樣）。
加入一層砂礫（高度大概為0.5cm）。
不含玻璃粉柱子
棉花團(tuán)或者玻璃棉團(tuán)的大小應(yīng)該可以足以塞入柱體底部，但是也不要太大，也不要讓棉花團(tuán)太緊實(shí)，否則的話會(huì)阻礙溶劑的流動(dòng)（圖3所示）。一般取你自己小指指尖大小的一團(tuán)就夠用。
用一根玻璃棒或者其他工具，把棉花團(tuán)或者玻璃棉團(tuán)放在柱體zui窄的部位，并保證與柱壁貼合。
緊緊的夾住柱體并關(guān)閉旋塞閥（如圖2右側(cè)那樣）。
在棉團(tuán)上鋪一層細(xì)砂礫，直至砂礫與柱體接觸（高度大概為2cm，如圖3所示）。這樣做的好處就是可以讓固定相基底更加穩(wěn)固，并防止不同段帶的快速流動(dòng)。
圖3. 上圖左側(cè)為恰當(dāng)大小棉團(tuán)的選擇，右側(cè)為不含玻璃粉柱體的砂礫所需量。
3.柱體填充
柱體填充的方式有很多。你可選擇自己得心應(yīng)手的方法作為慣用手法，但是你會(huì)發(fā)現(xiàn)不同尺寸的柱子會(huì)需要不同的填充方法。每種方法各有利弊，你可嘗試每一種方法，然后使用你自己的那一個(gè)。
干式填充法1
好處 | 弊端 |
不需要大量清洗 | 很那達(dá)到理想的柱體填充 |
你需要：
如上文第2部分介紹的那樣準(zhǔn)備色譜柱
找一個(gè)適用于過(guò)濾干燥固體的漏斗
一個(gè)用于吸取液體的工具
溶劑
二氧化硅或者氧化鋁
方法：
向柱體中倒入溶劑，為了去除其中的汽包，要讓溶劑流經(jīng)砂礫和棉團(tuán)（如圖4的步驟B）。
使用一個(gè)干燥潔凈的漏洞置于柱體上部，將二氧化硅或者氧化鋁（固定相）通過(guò)漏斗倒入柱體的溶劑中。這時(shí)要保證溶劑可以滴漏，以防止發(fā)生溢出（如圖4的步驟C）。
等待固定相慢慢沉降，并輕擊柱體，這樣可以保證二氧化硅或者氧化鋁在柱子里面沉降的更緊湊（如圖4步驟D）。
讓溶劑持續(xù)滴漏，待與固定相保持同一水平面時(shí)停止滴漏（如圖4步驟E）。
圖4.干式填充法1。
干式填充法2
好處 | 弊端 |
柱填充緊實(shí) | 需要大量溶劑 |
你需要
如上文第2部分介紹的那樣準(zhǔn)備色譜柱
溶劑所需漏斗
真空管
溶劑
二氧化硅或者氧化鋁
方法：
將二氧化硅干凝膠加入到柱體中，利用家用真空吸塵器通過(guò)連接到柱體底部的真空管將硅膠中的空氣吸走（如圖5步驟B），在下一步輕擊柱體時(shí)，填充效果會(huì)更加。
當(dāng)吸塵器還在運(yùn)行時(shí)，倒入溶劑（如圖5步驟D）。
讓溶劑繼續(xù)沿柱體流動(dòng)一直到達(dá)底部，這時(shí)可以關(guān)閉旋塞閥并取下真空吸塵器（如圖5步驟E）。
繼續(xù)向柱體中倒入五至六個(gè)色譜柱容量的溶劑，確保填充完成。
讓溶劑持續(xù)滴漏，待與固定相保持同一水平面時(shí)停止滴漏（如圖5步驟F）。
圖5. 干式填充法2。
漿料填充法
好處 | 弊端 |
快速簡(jiǎn)單 | 需要大量沖洗 |
你需要：
如上文第2部分那樣準(zhǔn)備柱子
燒杯兩個(gè)或者錐形燒瓶?jī)蓚€(gè)
玻璃棒或者巴斯德吸管
濕固體用漏斗
溶劑
二氧化硅或者氧化鋁
方法：
加入柱體三分之一體積的溶劑（圖6步驟B）。
用燒杯測(cè)量所需的二氧化硅或者氧化鋁用量。
使用分離燒杯或者錐形燒瓶測(cè)量溶劑，容量為二氧化硅體積的1.5倍。
向溶劑中加入二氧化硅，分若干次加入，每次少量，同時(shí)旋動(dòng)柱體。使用巴斯德吸管或玻璃棒攪動(dòng)漿料。
通過(guò)滴管或者直接將漿液倒入柱體。為了防止溢出，要保持柱體溶劑的滴漏（圖6步驟C）。
輕輕敲打柱體讓汽包漂浮到液面上并讓二氧化硅慢慢沉降（圖6步驟D）。
不斷加入漿料，直至所有漿料使用完畢。
使用滴管吸取溶劑沖洗柱體內(nèi)壁。
讓溶劑持續(xù)滴漏，待與固定相保持同一水平面時(shí)停止滴漏（如圖6步驟E）。
圖6.漿料填充法。
4.清空柱體
一旦你成功分離化合物，剩下需要做的就是清空并清理色譜柱，以備下次使用。為了加快整個(gè)清理過(guò)程，可以使用壓縮空氣洗脫所有溶劑并讓壓縮空氣持續(xù)吹過(guò)柱體兩小時(shí)。
這種清理方式可以將干燥自由流動(dòng)的二氧化硅填充物很容易倒入二氧化硅廢物容器。另外，還要將柱體頂端朝下放置于一個(gè)相對(duì)較大的燒杯上，并在通風(fēng)柜中放置一宿即可。
切記，二氧化硅灰塵的吸入會(huì)對(duì)人體造成傷害，一定要在排風(fēng)柜中清理柱體，并為自己采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)服，在清理柱體時(shí)要減少灰塵的產(chǎn)生。
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